Javascript está actualmente desactivado no teu navegador.Cando javascript está desactivado, algunhas funcións deste sitio web non funcionarán.
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Departamento de Ciencia, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Cataluña, España * Estes autores teñen algunhas ideas sobre este traballo Equal antecedentes da contribución: o ácido hialurónico (HA) é un polisacárido natural usado na produción de recheos dérmicos con fins estéticos.Dado que ten unha vida media de varios días nos tecidos humanos, os recheos dérmicos baseados en HA son modificados quimicamente para prolongar a súa vida no corpo.A modificación máis común nos recheos comerciais baseados en HA é o uso de 1,4-butanodiol diglicidil éter (BDDE) como axente de reticulación para entrecruzar as cadeas de HA.O BDDE residual ou sen reaccionar considérase non tóxico a <2 partes por millón (ppm);polo tanto, o BDDE residual no recheo dérmico final debe cuantificarse para garantir a seguridade do paciente.Materiais e métodos: este estudo describe a detección e caracterización dun subproduto da reacción de reticulación entre BDDE e HA en condicións alcalinas mediante a combinación de cromatografía líquida e espectrometría de masas (LC-MS).Resultados: Tras diferentes análises, comprobouse que as condicións alcalinas e a alta temperatura empregadas para desinfectar o hidroxel HA-BDDE favoreceron a formación deste novo subproduto, o composto "similar ao propilenglicol".A análise LC-MS confirmou que o subproduto ten a mesma masa monoisotópica que o BDDE, un tempo de retención diferente (tR) e un modo de absorbancia UV (λ=200 nm) diferente.A diferenza do BDDE, observouse na análise LC-MS que nas mesmas condicións de medición, este subproduto ten unha maior taxa de detección a 200 nm.Conclusión: estes resultados indican que non hai epóxido na estrutura deste novo composto.A discusión está aberta para avaliar o risco deste novo subproduto atopado na produción de hidroxel HA-BDDE (recheo dérmico HA) con fins comerciais.Palabras clave: ácido hialurónico, recheo dérmico HA, ácido hialurónico reticulado, BDDE, análise LC-MS, subproduto BDDE.
Os recheos a base de ácido hialurónico (HA) son os recheos dérmicos máis comúns e populares utilizados con fins cosméticos.1 Este recheo dérmico é un hidroxel, xeralmente composto por >95% de auga e 0,5-3% de HA, o que lles dá unha estrutura similar a un xel.2 HA é un polisacárido e o compoñente principal da matriz extracelular dos vertebrados.Un dos ingredientes.Consta de (1,4)-ácido glucurónico-β (1,3)-N-acetilglucosamina (GlcNAc) unidades de disacáridos que se repiten unidas por enlaces glicosídicos.Este patrón de disacáridos é o mesmo en todos os organismos.En comparación con algúns recheos baseados en proteínas (como o coláxeno), esta propiedade fai que o HA sexa unha molécula altamente biocompatible.Estes recheos poden presentar especificidade de secuencia de aminoácidos que pode ser recoñecida polo sistema inmunitario do paciente.
Cando se usa como recheo dérmico, a principal limitación do HA é a súa rápida rotación nos tecidos debido á presenza dunha familia específica de encimas chamadas hialuronidases.Ata o momento, describíronse varias modificacións químicas na estrutura do HA para aumentar a vida media do HA nos tecidos.3 A maioría destas modificacións tentan reducir o acceso da hialuronidasa aos polímeros de polisacáridos mediante a entrecruzamento das cadeas de HA.Polo tanto, debido á formación de pontes e aos enlaces covalentes intermoleculares entre a estrutura do HA e o axente de enlace cruzado, o hidroxel de HA entrecruzado produce máis produtos de degradación antienzima que o HA natural.4-6
Ata agora, os axentes de reticulación químicos utilizados para producir HA reticulado inclúen metacrilamida, 7 hidrazida, 8 carbodiimida, 9 divinil sulfona, 1,4-butanodiol diglicidil éter (BDDE) e poli(etilenglicol) diglicidil éter.10,11 BDDE é actualmente o axente de reticulación máis usado.Aínda que se comprobou que este tipo de hidroxeles son seguros durante décadas, os axentes de reticulación utilizados son reactivos reactivos que poden ser citotóxicos e, nalgúns casos, mutaxénicos.12 Polo tanto, o seu contido residual no hidroxel final debe ser elevado.O BDDE considérase seguro cando a concentración residual é inferior a 2 partes por millón (ppm).4
Existen varios métodos para detectar a concentración de BDDE de baixos residuos, o grao de entrecruzamento e a posición de substitución en hidroxeles de HA, como a cromatografía de gases, a cromatografía de exclusión de tamaño xunto coa espectrometría de masas (MS), os métodos de medición de fluorescencia de resonancia magnética nuclear (RMN) e Cromatografía líquida de alta resolución acoplada con matriz de diodos (HPLC).13-17 Este estudo describe a detección e caracterización dun subproduto no hidroxel final de HA reticulado producido pola reacción de BDDE e HA en condicións alcalinas.HPLC e cromatografía líquida-espectrometría de masas (análise LC-MS).Dado que se descoñece a toxicidade deste subproduto do BDDE, recomendamos que a súa cuantificación de residuos se determine de forma similar ao método que se realiza habitualmente sobre o BDDE no produto final.
A sal sódica obtida de HA (Shiseido Co., Ltd., Tokio, Xapón) ten un peso molecular de ~1.368.000 Da (método Laurent) 18 e unha viscosidade intrínseca de 2,20 m3/kg.Para a reacción de reticulación, comprou BDDE (≥95%) de Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, EUA).A solución salina tamponada con fosfato con pH 7,4 foi adquirida de Sigma-Aldrich Company.Todos os disolventes, acetonitrilo e auga utilizados na análise LC-MS foron adquiridos de calidade HPLC.O ácido fórmico (98%) adquírese como reactivo.
Todos os experimentos realizáronse nun sistema UPLC Acquity (Waters, Milford, MA, EUA) e conectáronse a un espectrómetro de masas cuadrupolar triple API 3000 equipado cunha fonte de ionización por electrospray (AB SCIEX, Framingham, MA, EUA).
A síntese de hidroxeles de HA reticulado comezouse engadindo 198 mg de BDDE a unha solución de hialuronato de sodio (NaHA) ao 10% (p/p) en presenza de álcali ao 1% (hidróxido de sodio, NaOH).A concentración final de BDDE na mestura de reacción foi de 9,9 mg/ml (0,049 mM).Despois, a mestura de reacción mesturouse e homoxeneizouse completamente e deixouse a 45 °C durante 4 horas.19 O pH da reacción mantense en ~12.
Despois, a mestura de reacción foi lavada con auga e o hidroxel final de HA-BDDE filtróuse e diluíuse con tampón PBS para acadar unha concentración de HA de 10 a 25 mg/mL e un pH final de 7,4.Para esterilizar os hidroxeles de HA reticulado producidos, todos estes hidroxeles son esterilizados en autoclave (120 °C durante 20 minutos).O hidroxel BDDE-HA purificado almacénase a 4 °C ata a súa análise.
Para analizar o BDDE presente no produto de HA reticulado, pesouse unha mostra de 240 mg e introduciuse no orificio central (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, USA; volume 0,5 ml) e centrifugouse a 10.000 rpm a temperatura ambiente. 10 minutos.Recolléronse e analizáronse un total de 20 µL de líquido extraíble.
Para analizar o estándar BDDE (Sigma-Aldrich Co) en condicións alcalinas (NaOH 1%, 0,1% e 0,01%), se se cumpren as seguintes condicións, a mostra líquida é 1:10, 1:100 ou ata 1:1.000.000 Se é necesario, use auga desionizada MilliQ para a análise.
Para os materiais de partida utilizados na reacción de reticulación (HA 2%, H2O, 1% NaOH e 0,049 mM BDDE), analizouse 1 mL de cada mostra preparada a partir destes materiais utilizando as mesmas condicións de análise.
Para determinar a especificidade dos picos que aparecen no mapa iónico, engadíronse 10 µl de solución estándar de BDDE de 100 ppb (Sigma-Aldrich Co) á mostra de 20 µl.Neste caso, a concentración final do patrón en cada mostra é de 37 ppb.
En primeiro lugar, prepare unha solución stock de BDDE cunha concentración de 11.000 mg/L (11.000 ppm) diluíndo 10 μL de BDDE estándar (Sigma-Aldrich Co) con 990 μL de auga MilliQ (densidade 1,1 g/mL).Use esta solución para preparar unha solución de BDDE de 110 µg/L (110 ppb) como dilución estándar intermedia.A continuación, use o diluente estándar intermedio BDDE (110 ppb) para preparar a curva estándar diluíndo o diluyente intermedio varias veces para acadar a concentración desexada de 75, 50, 25, 10 e 1 ppb.Como se mostra na Figura 1, atópase que a curva estándar BDDE de 1,1 a 110 ppb ten unha boa linealidade (R2>0,99).A curva estándar repetiuse en catro experimentos independentes.
Figura 1 Curva de calibración estándar BDDE obtida mediante análise LC-MS, na que se observa unha boa correlación (R2>0,99).
Abreviaturas: BDDE, éter diglicidil de 1,4-butanodiol;LC-MS, cromatografía líquida e espectrometría de masas.
Para identificar e cuantificar os estándares BDDE presentes no HA reticulado e os estándares BDDE na solución base, utilizouse a análise LC-MS.
A separación cromatográfica realizouse nunha columna LUNA de 2,5 µm C18(2)-HST (50×2,0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, EUA) e mantívose a temperatura ambiente (25 °C) durante a análise.A fase móbil está formada por acetonitrilo (disolvente A) e auga (disolvente B) que conteñen ácido fórmico ao 0,1%.A fase móbil elúese por gradiente de elución.O gradiente é o seguinte: 0 minutos, 2% A;1 minuto, 2% A;6 minutos, 98 % A;7 minutos, 98 % A;7,1 minutos, 2% A;10 minutos, 2% A. O tempo de execución é de 10 minutos e o volume de inxección de 20 µL.O tempo de retención de BDDE é duns 3,48 minutos (varía de 3,43 a 4,14 minutos segundo os experimentos).A fase móbil bombeouse a un caudal de 0,25 ml/min para a análise LC-MS.
Para a análise e cuantificación de BDDE por MS, o sistema UPLC (Waters) combínase cun espectrómetro de masas triplo cuadrupolo API 3000 (AB SCIEX) equipado cunha fonte de ionización por electrospray, e a análise realízase en modo de ións positivos (ESI+).
Segundo a análise de fragmentos iónicos realizada en BDDE, determinouse que o fragmento de maior intensidade é o correspondente a 129,1 Da (Figura 6).Polo tanto, no modo de monitorización multiión (MIM) para a cuantificación, a conversión de masa (relación masa-carga [m/z]) de BDDE é 203,3/129,1 Da.Tamén usa o modo de exploración completa (FS) e o modo de exploración iónica do produto (PIS) para a análise LC-MS.
Para verificar a especificidade do método, analizouse unha mostra en branco (fase móbil inicial).Non se detectou ningún sinal na mostra en branco cunha conversión de masa de 203,3/129,1 Da.En canto á repetibilidade do experimento, analizáronse 10 inxeccións estándar de 55 ppb (na metade da curva de calibración), resultando unha desviación estándar residual (RSD) <5% (datos non mostrados).
O contido residual de BDDE cuantificouse en oito hidroxeles de HA reticulado de BDDE autoclavados diferentes, correspondentes a catro experimentos independentes.Tal e como se describe na sección "Materiais e métodos", a cuantificación avalíase polo valor medio da curva de regresión da dilución estándar BDDE, que corresponde ao pico único detectado na transición de masa BDDE de 203,3/129,1 Da, cunha retención. tempo de 3,43 a 4,14 minutos Sen esperar.A Figura 2 mostra un cromatograma de exemplo do estándar de referencia BDDE de 10 ppb.A táboa 1 resume o contido de BDDE residual de oito hidroxeles diferentes.O intervalo de valores é de 1 a 2,46 ppb.Polo tanto, a concentración residual de BDDE na mostra é aceptable para uso humano (<2 ppm).
Figura 2 Cromatograma iónico do patrón de referencia BDDE de 10 ppb (Sigma-Aldrich Co), transición MS (m/z) obtida mediante análise LC-MS de 203,30/129,10 Da (en modo MRM positivo).
Abreviaturas: BDDE, éter diglicidil de 1,4-butanodiol;LC-MS, cromatografía líquida e espectrometría de masas;MRM, monitorización de reaccións múltiples;MS, masa;m/z, relación masa-carga.
Nota: As mostras 1-8 son hidroxeles de HA reticulado BDDE esterilizados en autoclave.Tamén se informa da cantidade residual de BDDE no hidroxel e do pico do tempo de retención de BDDE.Finalmente, tamén se informa da existencia de novos picos con diferentes tempos de retención.
Abreviaturas: BDDE, éter diglicidil de 1,4-butanodiol;HA, ácido hialurónico;MRM, monitorización de reaccións múltiples;tR, tempo de retención;LC-MS, cromatografía líquida e espectrometría de masas;RRT, tempo de retención relativo.
Sorprendentemente, a análise do cromatograma iónico LC-MS mostrou que en base a todas as mostras de hidroxel de HA reticulados en autoclave analizadas, houbo un pico adicional no tempo de retención máis curto de 2,73 a 3,29 minutos.Por exemplo, a Figura 3 mostra o cromatograma iónico dunha mostra de HA entrecruzado, onde aparece un pico adicional nun tempo de retención diferente de aproximadamente 2,71 minutos.O tempo de retención relativo (RRT) observado entre o pico recentemente observado e o pico de BDDE foi de 0,79 (táboa 1).Xa que sabemos que o pico recentemente observado está menos retido na columna C18 utilizada na análise LC-MS, o novo pico pode corresponder a un composto máis polar que o BDDE.
Figura 3 Cromatograma iónico da mostra de hidroxel de HA reticulado obtida por LC-MS (conversión de masa MRM 203,3/129,0 Da).
Abreviaturas: HA, ácido hialurónico;LC-MS, cromatografía líquida e espectrometría de masas;MRM, monitorización de reaccións múltiples;RRT, tempo de retención relativo;tR, tempo de retención.
Para descartar a posibilidade de que os novos picos observados sexan contaminantes orixinariamente presentes nas materias primas utilizadas, estas materias primas tamén foron analizadas mediante o mesmo método de análise LC-MS.Os materiais de partida analizados inclúen auga, 2% de NaHA en auga, 1% de NaOH en auga e BDDE na mesma concentración utilizada na reacción de reticulación.O cromatograma iónico do material de partida utilizado non mostrou ningún composto nin pico, e o seu tempo de retención correspóndese co novo pico observado.Este feito descarta a idea de que non só o material de partida pode conter calquera composto ou substancia que poida interferir co procedemento de análise, senón que non hai signos de posible contaminación cruzada con outros produtos de laboratorio.Os valores de concentración obtidos despois da análise LC-MS de BDDE e novos picos móstranse na táboa 2 (mostras 1-4) e o cromatograma iónico na figura 4.
Nota: As mostras 1-4 corresponden ás materias primas utilizadas para producir hidroxeles de HA reticulado BDDE autoclavados.Estas mostras non foron esterilizadas en autoclave.
Abreviaturas: BDDE, éter diglicidil de 1,4-butanodiol;HA, ácido hialurónico;LC-MS, cromatografía líquida e espectrometría de masas;MRM, monitorización de reaccións múltiples.
A figura 4 corresponde ao cromatograma LC-MS dunha mostra da materia prima utilizada na reacción de reticulación de HA e BDDE.
Nota: todos estes mídense na mesma concentración e proporción utilizadas para levar a cabo a reacción de reticulación.Os números das materias primas analizadas polo cromatograma corresponden a: (1) auga, (2) disolución acuosa de HA ao 2%, (3) solución acuosa de NaOH ao 1%.A análise LC-MS realízase para a conversión de masa de 203,30/129,10 Da (en modo MRM positivo).
Abreviaturas: BDDE, éter diglicidil de 1,4-butanodiol;HA, ácido hialurónico;LC-MS, cromatografía líquida e espectrometría de masas;MRM, monitorización de reaccións múltiples.
Estudáronse as condicións que levaron á formación de novos picos.Para estudar como as condicións de reacción utilizadas para producir o hidroxel de HA reticulado afectan á reactividade do axente de reticulación BDDE, levando á formación de novos picos (posibles subprodutos), realizáronse diferentes medicións.Nestas determinacións, estudou e analizouse o reticulante BDDE final, que foi tratado con diferentes concentracións de NaOH (0%, 1%, 0,1% e 0,01%) en medio acuoso, seguido de autoclave ou sen el.O procedemento das bacterias para simular as mesmas condicións é o mesmo que o método utilizado para producir o hidroxel de HA reticulado.Como se describe na sección "Materiais e métodos", a transición de masa da mostra foi analizada por LC-MS a 203,30/129,10 Da.Calcúlase o BDDE e a concentración do novo pico, e os resultados móstranse na Táboa 3. Non se detectaron novos picos nas mostras que non foron esterilizadas en autoclave, independentemente da presenza de NaOH na solución (mostras 1-4, Táboa). 3).Para as mostras esterilizadas en autoclave, só se detectan novos picos en presenza de NaOH na solución, e a formación do pico parece depender da concentración de NaOH na solución (mostras 5-8, Táboa 3) (RRT = 0,79).A figura 5 mostra un exemplo de cromatograma iónico, que mostra dúas mostras esterilizadas en autoclave en presenza ou ausencia de NAOH.
Abreviaturas: BDDE, éter diglicidil de 1,4-butanodiol;LC-MS, cromatografía líquida e espectrometría de masas;MRM, monitorización de reaccións múltiples.
Nota: O cromatograma superior: a mostra tratouse con solución acuosa de NaOH ao 0,1% e esteuse en autoclave (120 °C durante 20 minutos).Cromatograma inferior: a mostra non se tratou con NaOH, senón que se esteucou en autoclave nas mesmas condicións.A conversión de masa de 203,30/129,10 Da (en modo MRM positivo) foi analizada por LC-MS.
Abreviaturas: BDDE, éter diglicidil de 1,4-butanodiol;LC-MS, cromatografía líquida e espectrometría de masas;MRM, monitorización de reaccións múltiples.
En todas as mostras esterilizadas en autoclave, con ou sen NaOH, a concentración de BDDE reduciuse moito (ata 16,6 veces) (mostras 5-8, táboa 2).A diminución da concentración de BDDE pode deberse ao feito de que a altas temperaturas, a auga pode actuar como base (nucleófilo) para abrir o anel epóxido de BDDE para formar un composto de 1,2-diol.A calidade monoisotópica deste composto é diferente da do BDDE e, polo tanto, non se verá afectada.LC-MS detectou un cambio de masa de 203,30/129,10 Da.
Finalmente, estes experimentos mostran que a xeración de novos picos depende da presenza de BDDE, NAOH e do proceso de autoclave, pero non ten nada que ver co HA.
O novo pico atopado nun tempo de retención de aproximadamente 2,71 minutos foi entón caracterizado por LC-MS.Para este fin, BDDE (9,9 mg/ml) foi incubado nunha solución acuosa de NaOH ao 1% e autoclavado.Na Táboa 4, as características do novo pico compáranse co pico de referencia BDDE coñecido (tempo de retención aproximadamente 3,47 minutos).En base á análise da fragmentación iónica dos dous picos, pódese concluír que o pico cun tempo de retención de 2,72 minutos mostra os mesmos fragmentos que o pico BDDE, pero con diferentes intensidades (Figura 6).Para o pico correspondente ao tempo de retención (PIS) de 2,72 minutos, observouse un pico máis intenso despois da fragmentación nunha masa de 147 Da.Á concentración de BDDE (9,9 mg/mL) utilizada nesta determinación, tamén se observaron diferentes modos de absorbancia (UV, λ=200 nm) no espectro ultravioleta despois da separación cromatográfica (Figura 7).O pico cun tempo de retención de 2,71 minutos aínda é visible a 200 nm, mentres que o pico BDDE non se pode observar no cromatograma nas mesmas condicións.
Táboa 4 Resultados da caracterización do novo pico cun tempo de retención duns 2,71 minutos e do pico BDDE cun tempo de retención de 3,47 minutos
Nota: Para obter estes resultados, realizáronse análises LC-MS e HPLC (MRM e PIS) nos dous picos.Para a análise de HPLC, utilízase a detección UV cunha lonxitude de onda de 200 nm.
Abreviaturas: BDDE, éter diglicidil de 1,4-butanodiol;HPLC, cromatografía líquida de alta resolución;LC-MS, cromatografía líquida e espectrometría de masas;MRM, monitorización de reaccións múltiples;m/z, relación masa-carga;PIS, produto dixitalización iónica;luz ultravioleta, luz ultravioleta.
Nota: os fragmentos de masa obtéñense mediante análise LC-MS (PIS).Cromatograma superior: espectro de masas de fragmentos de mostra estándar BDDE.Cromatograma inferior: o espectro de masas do novo pico detectado (RRT asociado co pico BDDE é 0,79).O BDDE foi procesado en solución de NaOH ao 1% e autoclavado.
Abreviaturas: BDDE, éter diglicidil de 1,4-butanodiol;LC-MS, cromatografía líquida e espectrometría de masas;MRM, monitorización de reaccións múltiples;PIS, dixitalización iónica do produto;RRT, tempo de retención relativo.
Figura 7 Cromatograma iónico do ión precursor de 203,30 Da, e (A) o novo pico cun tempo de retención de 2,71 minutos e (B) a detección UV do pico estándar de referencia BDDE a 3,46 minutos a 200 nm.
En todos os hidroxeles de HA entrecruzados producidos, observouse que a concentración de BDDE residual despois da cuantificación LC-MS era <2 ppm, pero apareceu un novo pico descoñecido na análise.Este novo pico non coincide co produto estándar BDDE.O produto estándar BDDE tamén foi sometido á mesma análise de conversión de calidade (conversión MRM 203,30/129,10 Da) no modo MRM positivo.Xeralmente, outros métodos analíticos como a cromatografía utilízanse como probas límite para detectar BDDE en hidroxeles, pero o límite máximo de detección (LOD) é lixeiramente inferior a 2 ppm.Por outra banda, ata agora, a RMN e a MS utilizáronse para caracterizar o grao de reticulación e/ou modificación do HA nos fragmentos de unidade de azucre dos produtos de HA entrecruzado.O propósito destas técnicas nunca foi cuantificar a detección de BDDE residual a concentracións tan baixas como describimos neste artigo (LOD do noso método LC-MS = 10 ppb).
Hora de publicación: 01-09-2021